基孔肯雅病毒核酸檢測試劑技術審評要點來了！

前言

近期，廣東、廣西等地相繼報告基孔肯雅熱本地感染病例，引發公共衛生部門高度警惕。

如今正值我國基孔肯雅疫情防控的關鍵時期，在此背景下，8月28日，國家藥監局器審中心發布《基孔肯雅病毒核酸檢測試劑技術審評要點（試行）》（以下簡稱《審評要點》），我們將其中第二部分注冊審查要點的“分析性能研究”內容轉載如下：

注冊申請人應采用在符合質量管理體係的環境下生產的試劑盒進行分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數據、統計分析結果等詳細資料。

如申報產品適用不同的機型，需要提交采用不同機型進行性能評估的資料。如申報產品包含不同的包裝規格，需要對各包裝規格進行分析或驗證。

如果試劑同時適用於血清和血漿樣本類型，可選擇具有統計學意義數量的樣本進行不同樣本類型一致性的同源比對研究。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數據等。

分析性能評估用樣本一般應為真實樣本，如需稀釋，應采用陰性樣本進行稀釋。

建議著重對以下分析性能進行研究。

1.樣本穩定性

2.核酸（RNA）提取/純化性能

在進行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑製物。對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，並與質量較好的核酸提取試劑進行平行比對。若產品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行抗幹擾、精密度和檢出限的驗證。

3.精密度

應對精密度指標，如標準差或變異係數等的評價標準做出合理要求。應考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設計合理的精密度試驗方案進行評價。精密度評價試驗應包含核酸提取步驟。設定合理的精密度評價周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數據進行統計分析，獲得重複性、實驗室內精密度、實驗室間精密度、批間精密度等結果。

應至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、中/強陽性樣本，並根據產品特性設定適當的精密度要求，例如：

陰性樣本：待測物濃度為零濃度，陰性檢出率應為100%（n≥20）。

臨界陽性樣本：待測物濃度略高於試劑盒的檢出限，陽性檢出率應≥95%（n≥20）。

中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

4.分析特異性

4.1交叉反應

4.1.1生物信息學分析

分析應當包括人基因組和其他近緣病毒、引起發熱、關節疼痛、出疹等相似症狀的病原體。

4.1.2樣本驗證

采用滅活的臨床樣本或添加了滅活病原體培養物的陰性臨床樣本進行驗證，樣本基質應與預期檢測樣本類型一致，交叉反應研究用樣本主要考慮以下幾方麵：

4.1.2.1發熱伴出疹相關病原體

登革病毒（DENV-1～DENV-4）、辛德畢斯病毒、蓋塔病毒、黃熱病毒、寨卡病毒、麻疹病毒、風疹病毒、乙型腦炎病毒*、水痘-帶狀皰疹病毒*、單純皰疹病毒*、細小病毒B19*、人類皰疹病毒 6*、人類皰疹病毒 7*、肺炎衣原體*、誌賀氏菌*、淋球菌*、溶血性鏈球菌*、立克次體*。

注：“*”項為選擇性驗證的病原體，可在其中選擇不少於9個進行驗證。

4.1.2.2可能在血液樣本中存在的其他常見病原體

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、人巨細胞病毒。

4.1.2.3高濃度人類基因組DNA

病毒培養液的濃度單位可采用TCID50或PFU/mL，細菌培養物濃度單位可采用CFU/mL。建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的水平為106 CFU/mL或更高，病毒為105 PFU/mL或更高，也可采用其他合理的方法對病原體濃度進行定值，提交相關依據。

申請人應提供所有用於交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別信息和濃度確認等試驗資料。

4.2幹擾

4.2.1幹擾物質研究 

應根據所采集樣本類型，針對可能存在的內源/外源物質幹擾情況進行驗證，驗證推薦物質見表1。建議申請人在每種幹擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行試驗，檢測包含臨界陽性水平在內的基孔肯雅病毒樣本。對結果進行合理的統計分析，對比添加幹擾物質前後的Ct值差異。檢測的潛在幹擾物包括樣本中的原有物質及在樣本采集和處理期間引入的物質。

表1 用於幹擾試驗的物質

抗病毒藥：如利巴韋林

解熱鎮痛藥：如對乙酰氨基酚

抗生素：如阿莫西林

激素類藥物：如地塞米鬆

抗凝劑：如肝素

內源性幹擾物質：血紅蛋白、甘油三酯、白蛋白、膽紅素等

4.2.2病原體幹擾研究

應充分考慮臨床上容易與基孔肯雅病毒合並感染的病原體（如登革病毒等）及“4.1.1”中經生物信息學分析顯示存在較高同源性的病原體，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）基孔肯雅病毒核酸檢測的影響，進行幹擾研究。

5.檢出限

5.1檢出限的確定

建議采用至少3個樣本係列稀釋於與適用樣本一致的基質中，進行檢出限的確定。每個濃度梯度重複檢測，記錄不同濃度檢出的結果，采用適當的模型（如Probit分析）和分析方法，將具有95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。

5.2檢出限的驗證

選擇另外3個不同來源的樣本在檢出限濃度水平進行驗證，應達到95%陽性檢出率。

如檢測試劑包括多個可單獨報告的檢測靶標，應分別進行檢出限研究。

6.包容性

6.1 應當采用生物信息學分析方法對產品檢測的包容性進行研究，對所有已公布的基孔肯雅病毒核酸序列進行序列比對分析，並對靶標範圍內的序列差異是否影響申報產品檢出能力進行分析驗證。

6.2 驗證至少10個不同來源的臨床陽性樣本。研究應包括檢出限和重複性的驗證。

6.3 基因型覆蓋

應對基孔肯雅病毒主要基因型，包括西非型、東中南非型（包含印度洋分支）、亞洲型及其他流行變異株進行包容性研究。研究可采用毒株或臨床樣本，如果樣本難以獲得，亦可采用假病毒。

7.企業參考品驗證

根據主要原材料研究資料中的企業參考品設置情況，采用三批產品對企業參考品進行檢驗並提供詳細的試驗數據。

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